Thomas föddes i Fuenllana i Spanien 1488 och tillbringade sin barndom i Villanueva de los Infantes, varifrån han fått sitt efternamn. Hans föräldrar, en mjölnare, var kända för sina välgörenhetsgärningar, vilket påverkade Thomas djupt redan i unga år. Han utbildade sig vid universitetet i Alcalá, där han utmärkte sig. Han tog en teologiexamen och blev en populär professor i filosofi, konst och logik. Trots sina akademiska framgångar avböjde han en prestigefylld professur vid universitetet i Salamanca och valde istället att ansluta sig till augustinerbröderna i Salamanca 1516, avlägga sina löften 1517 och prästvigas 1518.

Han bidrog till att skicka de första augustinska missionärerna till den nya världen, närmare bestämt Mexiko, 1533 och främjade både studier och mission inom orden. År 1544 nominerades Thomas till ärkebiskop av Valencia, efter att först ha tackat nej till ärkebiskopsämbetet i Granada. Han accepterade motvilligt positionen 1545.

Han inrättade program där medel från de rika skulle gå till de fattiga, och han förvandlade sitt eget hem till ett soppkök och härbärge där hundratals människor fick mat varje dag.

Thomas dog den 8 september 1555 i Valencia, 67 år gammal, efter att ha drabbats av kärlkramp. Han helgonförklarades av påven Alexander VII den 1 november 1658. Hans liturgiska högtidsdag firas den 22 september. Sankt Thomas av Villanova är skyddshelgon för Villanova University i Pennsylvania, bland andra utbildningsinstitutioner och församlingar som är uppkallade efter honom.