Thomas wurde 1488 in Fuenllana, Spanien, geboren und verbrachte seine Kindheit in Villanueva de los Infantes, woher er auch seinen Nachnamen hat. Seine Eltern, ein Müller, waren für ihre wohltätigen Taten bekannt, die Thomas von klein auf tief beeinflussten. Er absolvierte eine höhere Ausbildung an der Universität von Alcalá, wo er sich durch einen Abschluss in Theologie auszeichnete und ein beliebter Professor für Philosophie, Kunst und Logik wurde. Trotz seines akademischen Erfolges lehnte er eine prestigeträchtige Professur an der Universität von Salamanca ab und trat stattdessen 1516 den Augustinermönchen in Salamanca bei, legte 1517 sein Gelübde ab und wurde 1518 zum Priester geweiht.

Er war maßgeblich an der Entsendung der ersten Augustinermissionare in die Neue Welt, insbesondere nach Mexiko, im Jahr 1533 beteiligt und förderte sowohl die Studien als auch die Missionen innerhalb des Ordens. Nachdem er zunächst das Erzbistum von Granada abgelehnt hatte, wurde Thomas 1544 zum Erzbischof von Valencia ernannt. Er nahm das Amt 1545 nur widerwillig an.

Er richtete Programme ein, bei denen Gelder der Wohlhabenden den Armen zugute kommen sollten, und verwandelte sein eigenes Haus in eine Suppenküche und ein Obdach, in dem er täglich Hunderte von Menschen versorgte.

Thomas starb am 8. September 1555 im Alter von 67 Jahren in Valencia, nachdem er an einer Angina gelitten hatte. Er wurde von Papst Alexander VII. am 1. November 1658 heiliggesprochen. Sein liturgischer Festtag wird am 22. September begangen. Der heilige Thomas von Villanova ist der Schutzpatron der Villanova University in Pennsylvania, neben anderen Bildungseinrichtungen und Pfarreien, die nach ihm benannt sind.